Et fluorescensfilter er en viktig komponent i fluorescensmikroskop.Et typisk system har tre grunnleggende filtre: et eksitasjonsfilter, et emisjonsfilter og et dikroisk speil.De er vanligvis pakket i en kube slik at gruppen settes sammen i mikroskopet.
Hvordan fungerer et fluorescensfilter?
Eksitasjonsfilter
Eksitasjonsfiltre sender lys med en bestemt bølgelengde og blokkerer andre bølgelengder.De kan brukes til å produsere forskjellige farger ved å justere filteret slik at bare én farge slipper gjennom.Eksitasjonsfiltrene kommer i to hovedtyper - langpassfiltre og båndpassfiltre.Eksiteren er vanligvis et båndpassfilter som bare passerer bølgelengdene som absorberes av fluoroforen, og dermed minimerer eksitasjon av andre fluorescenskilder og blokkerer eksitasjonslys i fluorescensemisjonsbåndet.Som vist med den blå linjen i figuren er BP 460-495, noe som betyr at den bare kan passere gjennom fluorescensen på 460-495nm.
Den er plassert innenfor belysningsbanen til et fluorescensmikroskop og filtrerer ut alle bølgelengder av lyskilden bortsett fra fluoroforeksitasjonsområdet.Filterets minimumsoverføring dikterer lysstyrken og glansen til bildene.Et minimum på 40 % overføring for ethvert eksitasjonsfilter anbefales slik at overføringen ideelt sett er >85 %.Båndbredden til eksitasjonsfilteret bør være helt innenfor fluoroforeksitasjonsområdet slik at senterbølgelengden (CWL) til filteret er så nært som mulig til toppeksitasjonsbølgelengden til fluoroforen.Eksitasjonsfilterets optiske tetthet (OD) dikterer bakgrunnsbildets mørke;OD er et mål på hvor godt et filter blokkerer bølgelengdene utenfor overføringsområde eller båndbredde.En minimum OD på 3,0 anbefales, men en OD på 6,0 eller høyere er ideell.
Emisjonsfilter
Emisjonsfiltre tjener hensikten med å la den ønskede fluorescensen fra prøven nå detektoren.De blokkerer kortere bølgelengder og har høy transmisjon for lengre bølgelengder.Filtertypen er også knyttet til et tall, f.eks. BA510IF i figuren (interferensbarrierefilter), som betegner bølgelengden ved 50 % av dens maksimale overføring.
De samme anbefalingene for eksitasjonsfiltre gjelder for emisjonsfiltre: minimumsoverføring, båndbredde, OD og CWL.Et emisjonsfilter med den ideelle CWL, minimum overføring og OD-kombinasjon gir de lyseste mulige bildene, med dypest mulig blokkering, og sikrer detektering av de svakeste emisjonssignalene.
Dikroisk speil
Det dikroiske speilet er plassert mellom eksitasjonsfilteret og emisjonsfilteret i en 45° vinkel og reflekterer eksitasjonssignalet mot fluoroforen mens det sender emisjonssignalet mot detektoren.Ideelle dikroiske filtre og stråledelere har skarpe overganger mellom maksimal refleksjon og maksimal transmisjon, med en >95 % refleksjon for båndbredden til eksitasjonsfilteret og en transmisjon på >90 % for båndbredden til emisjonsfilteret.Velg filteret med skjæringsbølgelengden (λ) til fluoroforen i tankene, for å minimere strølys og maksimere det fluorescerende bildets signal-til-støyforhold.
Det dikroiske speilet i denne figuren er DM505, så kalt fordi 505 nanometer er bølgelengden ved 50 % av maksimal transmisjon for dette speilet.Transmisjonskurven for dette speilet viser høy transmisjon over 505 nm, et bratt fall i transmisjonen til venstre for 505 nanometer, og maksimal reflektivitet til venstre for 505 nanometer, men kan fortsatt ha noe transmisjon under 505 nm.
Hva er forskjellen mellom langpass- og båndpassfiltre?
Fluorescensfiltre kan deles inn i to typer: langpass (LP) og båndpass (BP).
Langpassfiltre sender lange bølgelengder og blokkerer de kortere.Cut-on-bølgelengden er verdien ved 50 % av topptransmisjon, og alle bølgelengder over cut-on sendes av langpassfiltrene.De brukes ofte i dikroiske speil og utslippsfiltre.Langpassfiltre bør brukes når applikasjonen krever maksimal emisjonsinnsamling og når spektral diskriminering ikke er ønskelig eller nødvendig, noe som vanligvis er tilfelle for prober som genererer en enkelt emitterende art i prøver med relativt lave nivåer av bakgrunnsautofluorescens.
Båndpassfiltre overfører bare et bestemt bølgelengdebånd og blokkerer andre.De reduserer krysstale ved å la bare den sterkeste delen av fluoroforemisjonsspekteret overføres, reduserer autofluorescensstøy og forbedrer dermed signal-til-støyforholdet i autofluorescensprøver med høy bakgrunn, som langpassfiltre ikke kan tilby.
Hvor mange typer fluorescensfiltersett kan BestScope levere?
Noen vanlige typer filtre inkluderer blå, grønne og ultrafiolette filtre.Som vist i tabellen.
| Filtersett | Eksitasjonsfilter | Dikroisk speil | Barrierefilter | LED-lampe Bølgelengde | applikasjon |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485nm | ·FITC: Fluorescerende antistoffmetode ·Acidin oransje: DNA, RNA ·Auramin: Tuberkelbasill ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535nm | ·Rhodamine, TRITC: Fluorescerende antistoffmetode ·Propidiumjodid: DNA ·RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365nm | · Autofluorescensobservasjon ·DAPI: DNA-farging · Hoechest 332528, 33342: brukes til kromosomfarging |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405nm | · Katekolaminer ·5-hydroksytryptamin ·Tetracyklin: Skjelett, tenner |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Filtersett som brukes i fluorescensopptak er designet rundt de viktigste bølgelengdene som brukes i fluorescensapplikasjoner, som er basert på de mest brukte fluoroforene.Av denne grunn er de også oppkalt etter fluoroforen de er ment for avbildning, for eksempel DAPI (blå), FITC (grønn) eller TRITC (rød) filterkuber.
| Filtersett | Eksitasjonsfilter | Dikroisk speil | Barrierefilter | LED-lampe Bølgelengde |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450nm |
| Texas Red | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560nm |
| mCherry | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560nm |
Hvordan velger du et fluorescensfilter?
1. Prinsippet for å velge fluorescensfilter er å la fluorescens/emisjonslyset passere gjennom bildeenden så langt som mulig, og samtidig blokkere eksitasjonslyset fullstendig, for å oppnå det høyeste signal-til-støyforholdet.Spesielt for bruk av multifoton-eksitasjon og total intern refleksjonsmikroskop, vil den svake støyen også forårsake stor interferens på bildeeffekten, så kravet til signal/støyforhold er høyere.
2. Kjenn eksitasjons- og emisjonsspekteret til fluoroforen.For å konstruere et fluorescensfiltersett som genererer et høykvalitets, høykontrastbilde med svart bakgrunn, bør eksitasjons- og emisjonsfiltre oppnå høy overføring med minimal passbåndrippel over områdene som tilsvarer fluoroforeksitasjonstoppene eller emisjonene.
3. Vurder holdbarheten til fluorescensfiltre.Disse filtrene må være ugjennomtrengelige for intense lyskilder som genererer ultrafiolett (UV) lys som kan føre til "utbrenthet", spesielt av eksitatorfilteret ettersom det utsettes for hele intensiteten til belysningskilden.
De forskjellige fluorescerende prøvebildene
Ressursene samles og organiseres på Internett, og brukes kun til læring og kommunikasjon.Hvis det er noen brudd, vennligst kontakt oss for å slette.
Innleggstid: Des-09-2022